关于质粒转化
质粒转化是指将外源质粒导入原核细胞的过程。其中的转化是指将外源的脱氧核糖核酸分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。
将质粒脱氧核糖核酸导入细菌的过程称为转化。此感受态细菌细胞在氯化钙低渗溶液中膨胀为球状。质粒脱氧核糖核酸与氯化钙形成抗磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经42摄氏度短时间的热冲击处理，促进细胞吸收脱氧核糖核酸复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。在选择性培养平板上，可选出所需的转化子。
质粒转化步骤
质粒的转化，满满干货 原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。质粒的转化主要包含Ⅰ感受态细胞制备Ⅱ质粒DNA转化Ⅲ质粒DNA的提取（Ⅰ）感受态细胞制备1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min（4000r/min）。4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）6）4℃离心10min（4000r/min）。7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。8）可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。（Ⅱ）质粒DNA的转化1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。2）冰浴30min，离心管放到42℃保温90s（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。3）向离心管加800ulLB液体培养基，37℃振荡培养1h（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。4）取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30min。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16h，出现菌落。5）菌落结果：① 无菌落失败或者培养条件不充分② 布满菌落,呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致③ 布满菌落浓度太高，失败④ 出现菌落符合要求Ⅲ）质粒DNA的提取质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解，能够避免实验过程中的一些问题，或者能够更好的解决问题。各厂家提供的试剂盒中试剂不尽相同，一般的提取纯化试剂盒，主要包括以下试剂：A. 细胞悬浮试剂: 主要作用是将菌体细胞悬浮起来。菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒的提取纯度和得率都会下降。通常需要在里面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常选用Tris-HCl作为体系中pH稳定缓冲液。EDTA，金属离子螯合剂可以和细菌体内的金属离子结合而DNase的活性受到抑制。有的会有葡萄糖，可用来增加溶液粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉淀时间。B. 细胞裂解试剂：主要作用是裂解细胞，通过碱溶液的作用破坏细胞膜结构，使其双层膜结构改变，而导致细胞裂解。一般由一定浓度的NaOH和SDS组成。SDS的作用与后期中和过程中清除掉蛋白质等细胞杂质有关系。此步骤中需要注意的是，碱溶液的作用时间不能太长，也不可剧烈离心管，反之会导致碱破坏基因组DNA，导致同等大小的基因组DNA被提纯，造成污染。C. 中和试剂：主要作用使中和掉细胞裂解试剂中的碱性物质，并去除掉其中的蛋白等杂质物质。组份有醋酸钾和醋酸，或者乙酸钾和冰乙酸。D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的盐离子。DNA被试剂盒中的提取柱吸附之后，需要用wash buffer 洗脱掉多余的盐离子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇对后续酶切和测序反应会有影响，因此在后续洗脱DNA前，必须完全清除柱子中的乙醇。E. 洗脱Buffer: 主要作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通过重力的作用，使平衡buffer都流出。2.细胞收获：对于高拷贝质粒（培养液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培养液,离心去上清；对于低拷贝质粒（培养液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培养液，离心去上清。3. 细胞悬浮：加0.4mL的细胞悬浮液(containing RNase A)悬浮细胞，并使其混匀。4. 细胞裂解：加入0.4mL细胞裂解液，通过上下颠倒带盖子管子5次使其轻轻混匀，不要涡旋，之后在室温下放置5min.5. 中和：加入0.4mL的中和试剂，立即混合均匀。当大的细胞颗粒被处理后，可能会进行更剧烈的摇动。但是，不要涡旋！~12,000xg离心混合物10min. 如果是采用的4°离心，上清液需要恢复到室温，再加入到柱子中。6. 装柱：吸取步骤5中的上清液到平衡柱中。让混合液通过重力的作用流出，弃掉流出液。7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脱柱子量次。每次清洗让清洗液通过重力的作用流出，弃掉流出液8. 质粒DNA洗脱：加入0.9mL的Elution Buffer。让Elution Buffer通过重力的作用流出。不要强行弄出里面的液体。9. 质粒DNA沉淀：加入0.63mL异丙醇去析出，混匀，~12,000xg at/4°C离心30min。小心的去掉上清，之后风干10分钟10. DNA纯化：将管子中的DNA溶解到TE buffer中。将这些溶液转移到新管中。重组质粒鉴定的方法：① 双酶切后跑电泳；直接DNA电泳可判断整个DNA重组质粒是否正确。② PCR(插入片段在2kb以下时)，然后电泳。③ 送公司测序（最为准确的鉴定方式）。影响转化效率的因素：① 细胞状态和细胞密度: 培养菌最好选用传代次数少，且保存于-70℃或者-20℃。不要使用经过多次转接或者保存于4℃环境中培养菌。细胞生长密度以刚进入对数其为最好，可通过检测培养液的OD600值来判断，密度过高或者不足，都会影响转化效率。通常DH5α菌株在OD600的值为0.5左右，细胞密度在5*107个/ml左右比较合适。密度过高或者不足均会影响转化效率。② 质粒的质量和浓度：转化的质粒DNA中，超螺旋状态的质粒，转化效率最好。在一定浓度范围内，转化的效率与添加质粒的浓度成正比。不过在添加的质粒的量和体积过大的时候，转化效率也会降低。质粒的分子量越大，通常来说转化率也会降低。③试剂的质量：转化过程中所用的试剂，如氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率。④防止杂菌和DNA污染：实验需要在无菌条件下进行，所用的仪器和试剂均需要灭菌处理，并防止在实验过程中引入其他污染。⑤培养过程的条件：培养瓶中培养基的量关乎到菌体生长过程中的能量代谢。通常来说厌氧环境做出来的感受态的转化效率较低。建议500ml三角瓶液体培养基量不超过100ml, 250ml三角瓶液体培养基量不超过50ml. 培养基的pH值要适宜，接种前一般pH值在6.8-7.2，等培养结束后可以再测一下pH值最好在6.5以上（不低于6.0），表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。培养基中的各种离子和温度，也对形成好的感受态有关系。几种扩增常用感受态细胞：① 普通骨架载体cDNA产品DH5α：常用于质粒克隆，可用于蓝白斑筛选TOP10：适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能够保证高拷贝质粒的稳定遗传。TG1: 生长速度快，常用于噬菌体的制备，同时也可用于普通质粒的构建。CopyCutter：适用于有毒克隆。② 慢病毒载体质粒：Stbl3: 是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率Stable（NEB）：可用于逆转录病毒/慢病毒载体系统扩增。
Ti质粒的起源是什么啊
①Ti质粒的来源
大多数以植物作为宿主有机体的克隆载体都以Ti质粒为基础，Ti产生于一种称为根癌农杆菌的土壤细菌。
②Ti质粒的特点
根癌农杆菌侵入植物组织后，可导致冠瘿的癌性生长。在根癌农杆菌的感染过程中，Ti内称为T-DNA的部分整合到植物染色体DNA中。
③Ti质粒的应用
以Ti质粒为基础的克隆载体，利用T-DNA的整合能力，携带有用基因进入植物基因组中，这些基因可使植物具有抗病等有利特征。
再给你一段文章的检索是关于Ti质粒的
（1） Ti 质粒的结构与功能
Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti 质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类，Ti 质粒可分为4 类：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型(agrocinopine)。
Ti 质粒可分为4 个功能区域：①T-DNA区(transferred-DNA region)：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA；②Vir 区(virulence region)：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性；③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移；④Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。
T-DNA上共含有tms、tmr和tmt 3 套基因。其中tms和tmr 2 套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。tms基因组由iaaH和iaaM 2 个基因组成，控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径；tmr 基因组中的iptZ 负责由异戊烯焦磷酸和AMP 合成分裂素的反应；tmt 基因组的编码产物可催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。
此外，在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界(left border, LB)和左边界(right border, RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
（2）Ti 质粒的转化机理
根癌农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位会分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质能诱导Ti 质粒上的vir基因以及根癌农杆菌染色体上的一个操纵子表达。vir 基因产物将Ti 质粒上的T-DNA 单链切下，而根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA 结合形成复合物，转化植物根部细胞。整个过程大致可分为以下几个步骤：①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着；②根癌农杆菌对植物信号物质的感受；③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色体上操纵子的活化；④T-DNA 复合体的产生；⑤T-DNA复合体的转运；⑥T-DNA整合到植物基因组中。
（3）野生型Ti 质粒的改造和中间载体的构建
Ti 质粒是植物基因工程的一种天然载体。但野生型Ti 质粒不能直接用作克隆外源基因的载体。这主要表现在：①野生型Ti 质粒分子过大，因而在基因工程中操作起来十分麻烦；②野生型Ti 质粒上分布着各种限制型核酸内切酶的多个酶切位点，不论用何种限制型核酸内切酶切割，都会切成很大片段。而且即使在T-DNA 上也很难找到可利用的单一的酶切位点；③T-DNA上的tms和tmr 基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍转基因植物细胞的分化和植株的再生；④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨
酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；⑤野生型Ti 质粒没有大肠杆菌(Escherichia coli)的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。因此，必须对野生型的Ti 质粒进行改造后才能作为转基因植物的载体。
对野生型Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面：①删除T-DNA上的tms、tmr和tmt
基因；②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；③引入植物细胞的筛选标记基因，如细菌来源的新霉素磷酸转移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPT II)等，便于转基因植物细胞的筛选；④引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；⑤插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。⑥除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。由于大肠杆菌具有能与根癌农杆菌高效接合转移的特征。因此，为了使Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将T-DNA片段克隆进大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌农杆菌的Ti 质粒。带有重组T-DNA的大肠杆菌衍生载体称为中间载体(intermediate vector)，而接受中间载体的Ti 质粒则称为受体Ti 质粒(acceptor Ti plasmid)。构建中间载体是解决Ti 质粒不能直接导入目的基因的有效方法之一。
中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体(如pBR322 质粒)中插入了一段合适的T-DNA片段而构成的小型质粒。
（4）中间载体的表达构建
在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子，可使外源基因在植物细胞中表达；当启动子与显性选择标记基因及报告基因连接，构成嵌合基因(chimeric gene)时，这些标记基因同样能表达，从而可提供用于筛选和鉴定的表型。这类含植物启动子的中间载体称为中间表达载体(intermediate expression vector)。
目前已从动物、植物、病毒及微生物中分离到许多适用于植物的启动子。根据作用方式及功能可将启动子分为3 类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。
①组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。目前使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子、来自根癌农杆菌Ti 质粒T-DNA 区域的胭脂碱合成酶基因Ocs 启动子，后者虽来自细菌，但具有植物启动子的特性。
②组织特异启动子(tissue-specific promoter)又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。例如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29，豌豆的豆清蛋白(leguimin)基因启动子可在转化植物种子中特异性表达，马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因启动子在块茎中优势表达。
③诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。
目前植物基因工程中常采用的终止子是胭脂碱合成酶的nos终止子和Rubisco小亚基基因的3′端区域。
（5）植物表达载体的构建
中间表达载体是不能将外源基因转化进植物细胞。因此，必须将中间表达载体引入到上述已改造的受体Ti 质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体(它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基因转化中应用。为利用根癌农杆菌的Ti 质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与Ti 质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti 质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA 重组分子就可整合到植物细胞染色体DNA 上。
最后利用植物选择标记基因筛选转化细胞。简单而言，一元载体系统就是指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti 质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体(co-integrated vector)；由于该载体的T-DNA区与Ti 质粒Vir 区连锁，因而又称为顺式载体(cis-vector)。
双元载体(binary vector)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。其中之一是含有T-DNA转移所必需的Vir 区段质粒，它缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活T-DNA 的转移，故称为辅助Ti 质粒(helper Ti plasmid)；另一个则是含有T-DNA的质粒。一般作为目的基因的载体，由于其分子量较小，故称为微型质粒(mini-Ti plasmid)。它是一种寄主范围广泛的DNA转移载体质粒。它既含有大肠杆菌复制起始位点，又含有根癌农杆菌复制起始位点，实际上是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。这两种质粒在单独存在的情况下，均不能诱导植物产生冠瘿瘤。若根癌农杆菌细胞内同时存在这两种质粒时，便可获得正常诱导肿瘤的能力。因此，含有双元载体的根癌农杆菌细胞浸染植物时，就可以将含有目的基因的T-DNA整合进植物基因组中。
目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti 质粒介导的双元载体系统。首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌后，再导入携带辅助Ti 质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti 质粒上的vir基因，随后将微型质粒上的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。由于双元载体系统的T-DNA和Vir 区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体(trans-vector)。
（6）Ti 质粒介导的转移转化方法
目前已建立了多种根癌农杆菌Ti 质粒介导的植物基因转化方法，其基本程序包括：含重组Ti 质粒的根癌农杆菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培养，转化植株再生等步骤。
叶盘转化法：
叶盘转化法(leaf dish transformation)是Monsanto公司Morsch等人(1985)建立起来的一种转化方法。其操作步骤为：首先用打孔器从消毒叶片上取下直径为2～5mm 圆形叶片，即叶盘。再将叶盘放入培养至对数生长期的根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌浸染叶盘。
然后用滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将这种经浸染处理过的叶盘置于培养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄青霉素抑菌剂的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株。对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合有目的基因及其表达情况。
叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。实际上，其他的多种外植体，例如茎段、叶柄、胚轴、子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的方法进行转化。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前应用最多的方法之一。
原生质体共培养转化法：
原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。与叶盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。应用此法进行基因转化时，其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术体系。
整株感染法：
此法是模仿根癌农杆菌天然的感染过程，用根癌农杆菌直接感染植物而进行遗传转化的一种简单易行的方法。其做法是：人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。为了获得较高的转化频率，一般多采用无菌种子的实生苗或试管苗。用去除了致瘤基因的根癌农杆菌进行整株感染后，受伤部位一般不会出现肿瘤。在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导再生植株。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)上，将根癌农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙，可长出转化
的新枝条，新的转化枝条开花结实后，也可以获得转基因种子；或者通过真空渗透或农杆菌
浸泡拟南芥开花植株，等结实之后，利用筛选萌芽种子的方法，也可以得到转基因植株及种
子。
2 发根农杆菌介导转化法
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是与根癌农杆菌同属的一种病原土壤杆菌。但与根癌农杆菌不同的是，发根农杆菌从植物伤口入侵后，不能诱发植物产生冠瘿瘤，而是诱发植物产生许多不定根。这些不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根或发状根(hairy root)。发状根的形成是由存在于发根农杆菌中的Ri质粒(root inducing plasmid,根诱导质粒)所决定的。
Ri 质粒是发根农杆菌染色体外的遗传物质。属于巨大质粒，其大小为200～800kb。Ri质粒和Ti 质粒不仅结构、特点相似，而且具有相同的寄主范围和相似的转化机理。与Ri质粒转化相关的也主要为Vir区和T-DNA区2部分。Ri质粒的T-DNA也存在冠瘿碱合成基因，且这些合成基因只能在被侵染的真核细胞中表达。根据其诱导的冠瘿碱的不同，Ri 质粒可分为3 种类型：农杆碱型(agropine)、甘露碱型(mannopine)和黄瓜碱型(cucumopine)。与Ti质粒的T-DNA不同的是，Ri质粒的T-DNA上的基因不影响植株再生。因此，野生型Ri质
粒可以直接作转化载体。
与Ti 质粒相同，Ri质粒基因转化载体的构建也主要采用有共整合载体和双元载体系统。由Ri 质粒诱发产生的不定根组织，经离体培养后，一般都可再生完整的植株。因此，利用Ri质粒作为转基因植物的载体，同样具有诱人的前景。
3 病毒介导转化法
病毒侵染细胞后把其DNA 导入寄主细胞，并且这些病毒DNA 能在寄主细胞中进行复制和表达。其本身就是一种潜在的基因转化系统。因此，病毒可以作为植物转基因的一种载体。随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视。因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。
在已知的300 多种植物病毒中，单链RNA 病毒约占91%左右，双链DNA 病毒、单链DNA病毒各占3%左右。RNA不太适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。目前较为成熟的植物病毒载体是花椰菜花斑病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)和番茄金花叶病毒(tomato golden mosaic virus, TGMV)。
（1）CaMV DNA载体转化法
CaMV含有双链DNA基因组，将外源目的基因插入到CaMV DNA上，重组分子在体外包装成有感染力的病毒颗粒，就可高效转染植物原生质体，进而通过原生质体培养再生为整株植物。但CaMV 作为基因转化的载体也存在如下缺点，从而限制了其应用：①CaMV容纳外源DNA 的能力非常有限，即使是切除了非必须序列，也只能插入很小的片段；②CaMV 的寄主范围非常窄，主要是芸苔属(Brassica)植物如甘蓝和花椰菜等；③CaMV 是一种病原体，它的感染后会使寄主植物患病，降低产量和品质；④目前还没有发现有一种植物病毒DNA是可以整合到寄主染色体上的。这就不可能通过有性过程将插入的外源基因稳定地传递给感染植株的后代。⑤尽管CaMV DNA 可以感染植物，而带有外源基因的CaMVDNA 重组体则不能感染植物，这就必须通过原生质体予以克服。但通过原生质体再生植株对有些作物是非常困难的。并且植物病毒在植物组织中的传播也是受到限制的；⑥目前判断CaMV DNA感染的唯一的办法就是靠“症状”的表现，因此，对CaMV DNA载体来说，还需要一个更好的选择标记。
