几丁质酶

几丁质酶的优势

（1）唯一性：自然界唯一的带正电荷活性基团的纤维素。（2）人体必需的：人体健康和生存必需的第六元素，改善人体进入健康状态。（3）安全无毒副作用：100%的纯天然海洋生物制品。（4）营养加保健：有食物的营养，又具有辅助治疗的双重作用。（5）独特的双向调节：具双向免疫调节作用——免疫激活作用和免疫抑制作用。（6）易吸收利用：具生物适应性，易与机体亲和，被人体利用。（7）高纯度、高品质：现代高科技的奉献，指标国际领先，脱乙酰度高达90%以上。

什么生物里有几丁质酶

催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺反应的酶叫几丁质酶。几丁质，是甲壳类动物（如虾、蟹）、昆虫和其他无脊椎动物外壳中的甲壳中的甲壳质，(有几丁质的一般都会有几丁质酶，相适应嘛！）经脱乙酰化（提取）制得的一种天然高分子多糖体，是动物性的食物纤维.几丁质广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，主要的来源为虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软件动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌类的细胞壁等。其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，仅次于纤维素。

木霉的核型

对木霉核型的研究集中于20世纪90年代，研究者利用分子生物学手段对几种典型木霉的染色体条带数量、大小及基因的定位进行了分析。另外，有学者对哈茨木霉（T.harzianum）中细胞核在不同位置及生长阶段的形态特征进行了详细报道。Mantyla等（1992）利用CHEF（Contour-clamped Homogeneous Electric Field）凝胶电泳方法对长枝木霉（T.longibrachiatum）进行了核型分类研究，发现野生型T.longibrachiatum菌株QM6a具有7条染色体电泳条带，大小为2.8～6.9Mb，估计整个基因组的大小为33Mb，研究还发现纤维素酶编码基因cbh1，cbh2和egl2位于同一个连锁群（野生型的染色体Ⅱ上），而内切葡聚糖酶编码基因egl1则位于另外一条染色体上（野生型的染色体Ⅵ上）。Carter等（1992）利用脉冲场凝胶电泳技术研究了里氏木霉（T.reesei）菌株QM6a及其几个衍生菌株的染色体，也发现菌株都具有7条染色体，全基因组大小为33Mb；每条染色体的大小为3.2～6.2Mb。Herrera-Estrella等（1993）利用CHEF和旋转电极电泳技术研究了T.harzianum，T.viride和T.reesei三种木霉的染色体及相关基因的定位。在T.harzianum和T.reesei中发现了6条染色体带，在T.viride中发现了5条。这些染色体的大小为2.2～7.4Mb，估计全基因组大小在31～39Mb之间。Hayes等（1994）发展了木霉核型分类技术，能够从活的原生质体中分离并观察完整的染色体。利用该技术研究了T.harzianum菌株T12 his-2和T95 lys-1，以及两者的原生质体原养型融合子1295-22，发现T95 lys-1有4条染色体，大小为2.2～5.4Mb，而菌株T12 his-2和1295-22则只有两条染色体，三个菌株各自的最大染色体相似，大小为5.4Mb左右。Go-mez等（1997）利用CHEF凝胶电泳方法研究了T.harzianum菌株的遗传多样性及菌株之间的营养体相容性，发现全基因组大小为29.6～56.1Mb。同一核型之间能产生菌丝融合。研究者利用脉冲场电泳技术发现5个种类的木霉（含钩状木霉T.hamatum）都含有6条染色体，大小为3.7～7.7Mb，全基因组大小为30.5～35.8Mb，还发现42 KDa几丁质酶编码基因位于不同的木霉属染色体位置上（Csaba et al.，1996；杨合同，2009）。研究表明，几乎所有的木霉细胞是多核的（Harman，1993），Kubicek等（1998）利用吉姆萨（Giemsa）染色法（Shirane et al.，1989）观察了已市场化的生防木霉T.harzianum菌株1295-22的菌体内细胞核，并对其核内特定信息进行报道。研究中，为了取得良好的细胞核和菌丝染色特征差异，对不同的样品采用了多样化的染色时间（图9.1）。染色结果显示，细胞核的大小和数量在菌体内的不同部分有显著的不同。研究者在对生长于葡萄糖琼脂培养基上成熟菌丝的边缘及分生孢子刚刚开始形成的区域进行了重新测试，观察发现菌丝具有明显大小不同的尺寸，较大的大约有直径10μm，而较小的只有大约3μm（图9.1 A，B），还有几个菌丝直径大小介于两者之间为5μm。这种菌丝的多样性之前在木霉中描述过，其中只有小菌丝涉及重寄生。这些菌丝都是多核的：较小的菌丝每个细胞含有5～6个细胞核，而较大的细胞有非常多的细胞核，有的细胞会超过50个（图9.1A，B）。此外，不同位置的细胞核组具有不同的外观。有一些呈圆形，而其他的，大多是组合在一起的，外形显著拉长（图9.1C）。这些拉长的细胞核均面向菌丝的长轴，并排列成V字形。在其他真菌中也存在这样被拉长的细胞核，是由于细胞骨架分子的行动导致运动型细胞核迁移到其他地方（Aist et al.，1967），在哈茨木霉中很可能是同样的情况（图9.1C）。其中，瓶梗柄含有较少密集型核子簇，只在支撑菌丝的交界处和瓶梗的最低端有一到两个。分生孢子形成的烧瓶状细胞中包含一个单一的细胞核（图9.1D），显然是为了给新形成的孢子提供一个单一的细胞核。新生的分生孢子大多是单核的（图9.1E），虽然比较成熟的分生孢子可能是多核的（Stasz et al.，1988b），然而，这些细胞内可以看到细胞核有丝分裂，而且有丝分裂后的分生孢子会进行细胞分裂生成两个分生孢子（图9.1E）。这种细胞分裂并没有在木霉或者其他真菌分生孢子中被描述过。研究还观察到萌发孢子形成了新的菌丝，这些新形成的菌丝都是直径较小和胞内多核的，每个细胞都有两到三个细胞核（图9.1F）。然而，在菌丝尖端细胞核的数量要大于菌丝链的其余部分，而且根据它们的大小和染色的密度，菌丝尖似乎具有多个细胞核（图9.1F）。

木霉几丁质酶的基因克隆及应用

克隆几丁质酶编码基因是检测木霉几丁质酶多样性的可靠方法。目前克隆到的几丁质酶基因如表10.9所列。表10.9 从木霉中已经克隆的几丁质酶基因编码42kDa的内切几丁质酶基因与其他菌株例如Aphhanocladium sp.的几丁质酶基因具有高度同源性，也是经常被克隆的基因（Blaiseau et al.，1992）。不同木霉菌的ech42，其核苷酸序列差异高达35%，氨基酸序列差异达到17%，这种差异与菌株的系统发育有关，是木霉菌系统发育研究领域的一个很有用的基因，可以用来鉴别木霉菌的不同种群（Kullnig et al.，2001）。另外一个克隆次数较多，研究比较详细的几丁质酶基因是T.harziaum的chit33，在其他真菌中还未发现与该酶的编码基因序列相近的几丁质酶，但该酶与植物防卫反应涉及的几丁质酶具有高度同源性（Limon et al.，1995；Limon et al.，1999；孙红星等，2008）。利用其保守区域核苷酸设计的引物可和与T.asperellum亲缘关系较近的菌株中扩增到一些片段，而在T.atroviride，T.viride和T.asperellum中没有扩增到片段。因此，这个基因可能是T.harzianum和相近菌株中的特有基因，或者是该基因在亲缘关系较远的菌株中没有足够的保守区域，所以无法用PCR技术检测到。应注意，从木霉菌中克隆的所有几丁质酶基因都没有发现几丁质结合区。从T.harziaum中克隆了两种N-乙酰-β-D氨基酸已糖基酶（exc1和exc2，编码64kDa和68kDa的酶）基因，称为外切几丁质酶，两者的氨基酸序列同源性是72%，其中exc1编码64kDa的几丁质酶，具有7个潜在糖基化位点，与 T.atroviride的单拷贝 nag1 基因相似（Draborg et al.，1996）。Draborg等（1996）发现他所研究的菌株只有一种几丁质酶，其分子量为68kDa，他认为ech42中的大部分序列为T.harziaum或其相近菌株所持有，T.atroviride的DNA与nag1基因杂交后没有发现任何相似性。总的来说，从木霉菌中克隆到的几丁质酶的编码基因数目远低于纯化到的几丁质酶数量，几丁质酶具有多样性，不同的几丁质酶有不同的编码基因，还有很多几丁质酶编码基因有待于克隆。Kim等（1997）从T.virens中克隆到3个编码42kDa内切几丁质酶的基因。这些基因与T.harziaum的chit33或T.atroviride的nag1同源性问题需要进一步研究。目前，科学家们正尝试用遗传转化的高表达几丁质酶的木霉体作生防剂、用转基因菌生产几丁质酶农药制品，以及将木霉几丁质酶基因转入植物以得到抗病植物（杨合同等，2003b）。将绿木霉进行遗传改造分别建成几丁质酶基因cht42失效的菌株（KO）和组成性高表达的菌株（COE），得到的转化菌稳定且在生长速率、产孢、抗生素产生、在棉花根上定殖的效率及在土中生长和生存诸方面与野生型无异，但对棉苗立枯病的生防活性，KO菌株比野生型菌株显著降低，COE菌株比野生型菌株显著增强（Garcia et al.，1994）。有人认为增加高度保守的42kDa内切几丁质酶编码基因Th-ch的拷贝数可提高木霉生防效果。但也有人发现，虽然带有多拷贝ech42基因的哈茨木霉遗传改造菌株在真菌细胞壁诱导条件下，胞外几丁质酶活性激增至原菌株的42倍，但对立枯丝核菌和白绢病菌的生防效果无重大差异（Viterbo et al.，2001）。将木霉几丁质酶基因导入寄主植物中，能够提高寄主几丁质酶的表达水平（黄玉杰等，2002；孙红星等，2008）。Lorito（1998）首次将哈茨木霉的内切几丁质酶基因chit42转化到烟草和马铃薯中，并在不同的植物组织中高水平表达，对植物的生长发育未产生不良影响。筛选的转基因植株表现了对叶部病菌细交链孢菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢菌的完全抗病性或高度耐病性。用木霉的单个几丁质酶基因转化植物，获得了高效而广谱的抗病性，克服了来源于植物或细菌的几丁质酶基因转化植物后表达水平低的缺点。随后Bolar等（2000）又将哈茨木霉的内切几丁质酶基因由农杆菌介导转化到苹果植株中，转基因植物对苹果黑星病的抗性明显提高，但也对苹果树的生长有负面影响。现在许多实验室通过几丁质酶基因工程来提高烟草、马铃薯、卷心菜、苹果、西红柿、葡萄、柠檬、林木和其他植物的抗病性。Lorito等（1999）用农杆菌介导并由强启动子35 S控制，已成功地将内切几丁质酶基因Th-ent2转入烟草等双子叶植物中，转化子含有单拷贝或多拷贝的外源基因，但拷贝数并不影响内切几丁质酶在植物体上的活性。在转基因烟草叶部和茎部，内切几丁质酶基因得到高水平组成性表达（可达到烟草叶片蛋白的2%），在花及根部表达水平较低。水解酶启动植物的防御反应中木霉菌产生的几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶被认为在抗植物病原真菌中发挥重要作用，有的研究认为寄主感染时，这两类酶活性一起增高（Pintortoro et al.，1999）。

影响木霉蛋白分泌途径效率的生理和突变调控

在真核细胞中分泌蛋白进入内质网后，在伴侣分子、糖基化酶和氧化还原酶调控下进行折叠。正确折叠的蛋白被输送到高尔基体，在这里进行蛋白修饰，然后被分泌到细胞外。过量表达的外源蛋白、非正确折叠蛋白、错误折叠蛋白、效率低下的分泌蛋白或其他有害的分泌蛋白的积累，严重影响蛋白的转运和分泌，会对细胞产生压力，比如分泌压力，低产量蛋白或由于细胞接触各种化学品，而抑制蛋白折叠、转运等都会引起分泌压力。11.1.4.1 非折叠蛋白响应非折叠蛋白响应（Unfolded Protein Response，UPR）是真核细胞蛋白分泌途径中的一种重要调节机制，是细胞应对分泌压力而出现的一种响应机制。内质网中未正确折叠的分泌蛋白能启动UPR途径（Hetz et al.，2009；Malhotra et al.，2007），当未正确折叠蛋白在内质网中累积时，编码内质网折叠蛋白和伴侣分子的基因、编码内质网相关蛋白降解途径的基因和一部分转运蛋白基因及糖基化相关基因将被诱导表达。研究发现T.reesei中UPR途径及其激活机制与其他生物的既有相似又有不同之处。当内质网中未正确折叠蛋白积累时，它们结合内质网中伴侣分子BiP，少量BiP与IRE1蛋白内质网膜上的IRE1蛋白绑定时，就会激活UPR途径。IRE1蛋白激活时进行磷酸化。在T.reesei中过表达IRE1时，大量相关基因的转录水平提高，有pdi1，内质网伴侣分子基因bip1和lhs1，糖基化途径基因pmi40，转运通道基因sec61和脂类生物合成基因ino1。这说明UPR涉及很多基因。在T.reesei中表达抗体的Fab片段将会导致pdi基因表达的明显上调，这可能是由于外源蛋白在内质网的积累引发UPR后造成的（Saloheimo et al.，1999）。T.reesei中编码磷酸酶，使IRE1 蛋白去磷酸化，消除UPR响应的基因ptc2已经被克隆（Valkonen et al.，2004）。介导UPR的蛋白是HAC1（Cox et al.，1996），T.reesei的hac1基因和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）hacA基因已经被克隆，发现激活UPR的是具有20个核苷酸的内含子拼接到hac1/A mRNA上（Saloheimo et al.，2003）。Hac1/A mRNA在5’端区大约有200个核苷酸被截断，同时上游开放阅读框架（uORF）从 mRNA 上脱离。这说明 T.reesei 中hac1/A是通过双重机制诱导表达的，内含子剪接恢复成一个活跃的开放阅读框，不使用常规翻译开始位点的uORF，用另一个转录起始点替代。细胞中感受未折叠蛋白的是一个ser/thr跨膜激酶Irelp，它能检测到未折叠蛋白的聚集，并将信号传递到细胞核内，诱导UPR特异转录因子HAC1mRNA的非传统性剪接。在UPR响应发生时，IRE1的N-端感受信号，并多聚化激活C端的蛋白激酶和RNase活性，然后进一步激活下游转录调控因子HAC1。VoIkonen（2003）克隆了T.reesei中的ire1基因，发现其与S.cerevisiae中的IRE1 功能同源，他同时在T.reesei中过表达ire1，发现ire1能诱导一些内质网伴侣分子和折叠酶的表达。转录调控基因hac1可结合到UPR功能基因pdi1等基因的上游启动转录。丝状真菌中HAC1mRNA剪切过程是5’端区域被截短并除去20nt的内含子。HAC1因子入核后结合在UPR响应基因启动子区的非折叠蛋白响应元件区域，促使UPR相关的折叠酶、伴侣分子和糖基化修饰酶等的表达，以实现对内质网压力的响应。内质网压力响应与内质网相关蛋白降解途径（ER-Associated Protein Degradation，ERAD）是紧密相连的，ERAD可将错误折叠或未组装的蛋白直接导入蛋白酶体被26 S巨大蛋白酶降解。HAC1为UPR途径中重要的调控转录因子，当蛋白质在内质网积累，跨膜感受器将刺激信号传递给HAC1，然后激活UPR途径，提高分子伴侣和折叠酶的表达。在UPR途径中具有重要作用。HACA属于bZIP型家族的转录因子，它在DNA结合结构域下游含有一个典型的亮氨酸二聚体基序结构。研究显示，hac1及其靶基因pdi1，bip1（编码二硫键异构酶、蛋白折叠伴侣）在低生长速率下出现诱导转录，说明低生长速率下蛋白分泌受到了限制（Pakula et al.，2005）。而且，pdi1，bip1的转录也与纤维素酶基因一起受到乳糖、槐糖的诱导（Foreman et al.，2003）。这都说明，即使不添加外源蛋白折叠抑制剂（例如二硫苏糖醇DTT），蛋白分泌压力的提高也可使蛋白折叠过程做出应答。同样，在T.reesei中hac1/hacA基因也通过一个由UPR诱导的非常规内含子的剪切机制进行剪接（Saloheimo et al.，2003）。这些实验结果都显示在丝状真菌中表达外源蛋白将会造成UPR响应并使相应的伴侣分子和折叠酶的表达上调，目前的研究表明这些变化是由上游的IRE1和HAC1调控的。最近，在研究蛋白折叠和分泌抑制剂对T.reesei的影响时，发现一种新的分泌压力响应机制（Pakula et al.，2003）。该途径在有分泌压力时发挥作用，下调一些基因的转录水平。只有正确折叠的蛋白被转运到高尔基体，进一步修饰，调整蛋白的功能和稳定性。用DTT，BFA或者能打破Ca2+平衡并抑制蛋白折叠或者蛋白转运出内质网的A23187处理细胞时，纤维素酶和木聚糖酶主要编码基因的转录水平迅速降低，导致这些蛋白合成量迅速降低。当用DTT处理携带标记基因的完整cbh1启动子或在上游161位点断裂的cbh1启动子的菌株时，标记基因的mRNA量并没有减少，这说明基因调控发生在转录水平，并在上游161位点以后。这种分泌压力响应机制只在 T.reesei和A.niger 中被检测到（Al-Sheikh et al.，2004），这点不同于其他丝状真菌。这种新的途径被称为RESS（REpression under Secretion Stress），认为内质网中在基因转录水平终止新蛋白合成，处理未折叠蛋白的另一种新方式。目前已经有400余个和蛋白分泌压力响应有关的基因被鉴定。11.1.4.2 突变体Suh等（1986）和Byers（1981）在尝试分离T.reesei的温度敏感型突变体时发现sec突变体的分离程序基于酵母的单细胞特点，而不适合于多细胞的生物体。在一系列ts突变体中，共有两大类型：突变体为温度敏感型的，在37℃能生长；突变体能在37℃正常生长但其萌发需在25℃。b类突变体在37℃分泌的蛋白质量很少。但是，与酵母的sec突变体不同，生长对温度的敏感性与蛋白分泌障碍之间没有直接关联。当有2-脱氧葡萄糖存在时，T.reesei的一些突变菌株可以在纤维二糖为碳源时产生纤维素酶，而这些突变菌株是超分泌型的，例如菌株 RUT C-30和RL-P37（Eveleigh et al.，1979；Mandels et al.，1976；Merivouri et al.，1987）。当初使用这种筛选方法的目的是想得到碳源分解物阻遏型的突变菌株［在基因水平上已被Ilmen等（1996）所证实］，但生物化学研究表明，这些突变体中也发生了其他一些变化，包括粗糙内质网及粗糙内质网衍生的泡囊等细胞结构的大量增加（Ghosh et al.，1982，1984）。另外，通过亚细胞组分分析，在T.reesei突变体RUT C-30的增生内质网上还发现了一些酶的活性（Glenn et al.，1985），这些酶一般存在于其他真核生物的高尔基体中。由此可以判断T.reesei菌株RUT C-30是一个内质网发生突变的菌株。在功能上，现在还不知道该突变是否与碳源分解物阻遏基因cre1相关（Ilmen et al.，1996）。魏松环等（2009）克隆了T.reesei内质网压力响应途径中的调控蛋白基因hac1和分子伴侣基因hsp70，成功地进行了T.reesei转化。对表达hsp基因的转化子T47-hsp和T112-hsp的胞外分泌蛋白总量进行了检测，相对于各自的出发菌株 T47和T112，T47-hsp和T112-hsp的胞外蛋白分泌总量有一定程度降低，但对胞外分泌蛋白CBHI活力测定结果显示：T47-hsp和T112-hsp菌株 CBHI 酶活均比出发菌株有提高，说明过量表达分子伴侣HSP70可提高内源蛋白的分泌量。液泡蛋白分选受体基因vps10编码类型I跨膜受体蛋白，有四个保守结构域，是完成运输功能所必需的。通过与GFP融合表达观察到Vps10p主要位于高尔基体和液泡前体。尽管Vps10p能够识别几种重组体蛋白及异常蛋白并靶向运输至液泡降解，但是它对外源蛋白的产量的影响尚被知之甚少。为了研究里氏木霉（T.reesei）蛋白分泌途径中的液泡蛋白分选受体vps10 基因的功能，于海娜（2011）利用基因敲除技术构建了里氏木霉（T.reesei）vps10基因缺失菌株，并对其进行了生长和产酶分析。发现基因缺失菌株的生长状态与野生型菌株基本一致，生物量略有提高，对纤维素酶的分泌影响不显著。在Yoon（2010）最新的研究中，在米曲霉（Aspergillus oryzae）中破坏AoVps10基因，使外源蛋白CPY和HLY产量分别提高了3倍和2.2倍。这是首次关于破坏一个液泡分选受体基因而导致外源蛋白产量提高的报道。11.1.4.3 细胞膜和细胞膜组分对木霉蛋白分泌途径的影响有些丝状真菌，如果向培养基中加入去污剂例如吐温-80，脂肪酸或者磷脂，其产酶能力能够得到提高（Reese et al.，1969，1971）。这种效应的生物化学基础，应是通过刺激分泌途径中的限制性环节表现出来的，向T.reesei培养基中加入胆碱或者吐温80，都能够促进质膜增长及蛋白质的分泌（Schreiber et al.，1986）。另外，电子显微镜检查、化学成分分析及标志性酶分析表明，含胆碱培养基中生长的木霉菌丝中线粒体和内质网的含量也比对照有增加。因此，胆碱对蛋白质分泌的促进效应，可能与蛋白分泌有关的细胞结构“瓶颈”存在关联，其机理与RUT C-30突变有一定程度的相似性。用脂肪酸处理也能促进蛋白质的分泌，其过程和机理与此相似（Panda et al.，1987）。小泡在分泌途径的各个步骤中都起着重要作用，因此，质膜的流动性也应在蛋白质的分泌中有一定影响。为了证明这个假设，有人研究了一些影响质膜完整性或者流动性的因子。Merivouri等（1987）发现，2%（v/v）的乙醇能够抑制 T.reesei 超分泌型菌株 RL-P37的纤维素酶分泌，但对其亲本菌株没有影响。令人感兴趣的是，分泌蛋白的糖基化方式也因为乙醇的加入而发生改变。但也有不同的报道，Haab等（1993）发现T.reesei RUT C-30的蛋白分泌对乙醇的耐受性显著高于亲本菌株。对乙醇耐受性的这种差异在糖基化蛋白（CBHI和CBHII）及非糖基化蛋白（木聚糖酶Ⅱ）中均被发现，表明乙醇不影响糖基化相关步骤。Northern分析表明，乙醇还能减少纤维素酶mRNA的数量，因此能够干预纤维素酶基因的转录。这些研究者解释，对乙醇的高度耐受性源于细胞质膜固醇成分的改变，而这种改变又与筛选突变体时所用培养基中含有胆酸有关。Gorka-Niec等（2010）发现1M山梨糖醇对T.reesei蛋白质分泌有很大影响，减少将近10倍分泌量。分泌蛋白和膜蛋白是通过依赖SNAREs的胞外分泌途径到达质膜，SNAREs的作用是保证介导运输小泡与目标膜特异融合，位于运输小泡上的叫作v-SNAREs，而位于靶膜上的为t-SNAREs。v-SNAREs和t-SNAREs 特异性识别结合后形成 SNAREs 复合体（trans-SNAREs Complexes），并通过这个结构将运输小泡的膜与靶膜拉在一起，实现运输小泡特异性停泊和融合。T.reesei 具有两个质膜突触融合蛋白样 t-SNAREs受体-Ssolp和Sso2p，Ssolp与次顶端质膜上的受体v-SNARE Snclp结合而Sso2p则与顶端质膜上的受体Snclp结合，考虑到菌丝的生长区主要在顶端，Sso2p可能主要含有与菌丝的顶端生长有关的物质例如细胞壁合成的酶类，而Sso1p则负责水解酶类及膜蛋白的运输。液泡蛋白在高尔基体中被分选出来并通过内含体运输到液泡中，液泡对维持细胞质流动性、蛋白水解、分选及细胞间的转运有重要的作用。胞外分泌物质和膜蛋白都是通过内吞作用实现的，内吞的蛋白在早期的内涵体内被分选出来，经过反向循环被带到质膜，或者通过晚期的内涵体进行降解。v-SNARE Snclp就是一种最后经过反向循环又回到质膜的蛋白，内吞泡对维持胞外蛋白的分泌和膜质的极性又有非常重要的作用，虽然其间接作用于蛋白的分泌过程，却起着关键作用。11.1.4.4 碳源、pH、温度等环境因素对木霉蛋白分泌途径的影响Suarez等（2005）研究了分别以几丁质、其他真菌细胞壁为碳源时，T.harzianum的分泌蛋白质表达情况。研究发现，在不同的培养条件下胞外蛋白组存在显著差异，但一种新型的天冬氨酸蛋白酶的表达量是最高的，因而猜测这种蛋白质在其腐生生活中起主要作用。研究结果还发现，两个菌株除了在分泌量上的差异之外，纤维素酶的组成上有明显的差异。T.reesei CL847分泌至胞外的蛋白种类较多，而T.reesei RUT C-30 则倾向于只分泌纤维素酶。Monteiro（2010）分别在含有菜豆壳球孢菌（Macrophomina phaseolina），镰刀菌（Fusarium spp.）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）病原真菌细胞壁的培养液中培养T.harzianum ALL42，提取胞外蛋白。经双向蛋白电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术检测分析，在这3种培养液中共发现60种分泌蛋白，其中7种蛋白是细胞壁诱导蛋白，分别是内切几丁质酶、β-葡糖苷酶、a-甘露糖苷酶、酸性磷酸酶、a-1，3葡聚糖酶和蛋白酶，这些酶在培养液上清中也能被检测到。其余53种蛋白未鉴定出来，可能是新蛋白或是还未被测序的蛋白。伍红（2011）发现T.reesei QM9414在发酵培养过程中的胞外分泌蛋白的总量变化与其培养液中碳源的成分有着密切的关系。在纤维素、木聚糖、乳糖、甘油、葡萄糖等不同碳源条件下培养QM9414，对纤维素酶、木聚糖酶的活性差异及其培养液中总分泌蛋白的表达差异进行了分析。发现纤维素、乳糖和木聚糖均可诱导纤维素酶和木聚糖酶的合成；而葡萄糖是两种酶合成的抑制性碳源。其中，以纤维素和乳糖为碳源的培养液中，蛋白合成的速度及总量都显著高于其他碳源，其次是以木聚糖为碳源的培养液，再其次是甘油为碳源的培养液，蛋白质合成速度及总量都很低的是葡萄糖为碳源的培养液，说明碳源对T.reesei蛋白质合成代谢的调控作用很明显。纤维素、乳糖、木聚糖都可以诱导胞外分泌蛋白质基因表达。从蛋白合成总量来看，纤维素和乳糖的诱导能力强于木聚糖，与以前的报道一致（Suto et al.，2001；凌敏等，2009）。柳常青（2009）发现T.reesei在以葡萄糖或甘油为碳源时仅 CBHII，BXL和AxeI 3种纤维降解酶有微量表达，这3种酶可能是T.reesei组成型表达的纤维降解酶。纤维二糖能够诱导CBHI，CBHII，EGI，EGIII，BXL，AxeI和AglI 较高水平的表达。纤维素纸浆可诱导 CBHI，CBHII，EGI，EGII，EGIII，EGIV，ManI，ManII，AxeI，BXL和AglI等11种酶的大量表达，表达量占分泌组的61%。纤维素诱导的纤维降解酶组分比例情况与纤维二糖条件很相似，但表达量和酶活性都有显著上升。不少报道也证明了这点（Wrleitner et al.，2003；Mach et al.，1996）。除了碳氮源外，pH是影响微生物产酶量的主要因素，它对代谢通路、工业产酶量和酶合成效率都有影响。据报道，T.reesei在不同pH时的蛋白分泌量有很大变化。Sunil等（2011）发现 T.reesei 野生菌株（QM6 a）及其突变体（QM9414，RUT C-30，QM9414MG5）这4个菌株中，纤维素水解酶包括纤维素内切酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶在不同pH培养基中表达水平都有变化。对在不同pH培养基中特异表达的蛋白进行聚类分析，发现 T.reesei 野生菌株（QM6 a）及其突变体（QM9414，Rut-C30，QM9414MG5）分泌酶类所占比例相似，但明显随着pH的变化和菌株的不同而表达量不同。在pH为9.0时，T.reesei菌株QM6 a和RUT C-30降解纤维素效率明显降低，具有较低的酶活性，细胞生长速度明显降低；RUT C-30菌株在pH为4.0时纤维二糖水解酶I和外切葡聚糖酶Ⅱ的蛋白丰度最大，这表明这两种酶的表达水平最高；而内切葡聚糖酶Cel74a，β-1，3-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶等蛋白在pH为5.0时表达量最高；在pH在3～5之间时纤维素水解蛋白的丰度明显较高，纤维素降解能力相应增强。半纤维素水解酶包括GH11内切1，4-β-木聚糖酶、GH11木聚糖酶III、GH54 阿拉伯呋喃糖酶、GH5β-甘露聚糖酶、GH43木糖酶/阿拉伯糖苷酶，GH39 β-木糖酶、GH5 内切β-1，6-半乳聚糖酶、植酸酶等在不同pH环境中都能检测到。pH在3.0～7.0 范围内T.reesei和突变体产半纤维素降解酶量并没有受到明显影响，在酸性条件下，半纤维素水解蛋白的分泌量最大。木聚糖酶Ⅰ～Ⅳ中木聚糖Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别在pH为4.0～4.5，4.0～6.0和6.0～6.5时分泌量最大（Tenkanen et al.，1992 a；Torronen et al.，1995；Xu et al.，1998；Sunil et al.，2011）。在碱性条件下各类纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解蛋白、肽酶、几丁质酶和运输蛋白的分泌量均受到显著影响。在木霉菌株培养过程中，经常是碳源与培养基的pH协同作用于木霉菌的蛋白分泌表达，Bailey等（1993）发现T.reesei RUT C-30在pH为7.0时木聚糖酶分泌量最大，而在以纤维素和木聚糖作为主要碳源时纤维素酶在pH为4.0时分泌量最大。Xiong等（2004）报道T.reesei在乳糖培养基中培养时，木聚糖酶I在pH为4.0、木聚糖酶Ⅱ在1 pH为6.0时分泌量达到最大。培养温度对木霉纤维素酶的分泌量来说很重要，而且温度效应具有菌株特异性。Merivouri等（1990）发现在28℃培养时，T.reesei RUT C-30的纤维素酶产量为亲本菌株的3倍，而在30℃培养时则仅为2倍。利用酶活性分析及电泳技术发现，温度的升高能够减少纤维素酶但能增加木聚糖酶的分泌量，这种效应对T.reesei亲本菌株QM9414和突变菌株RUT C-30来说是相似的。T.reesei QM9414 内切葡聚糖酶的分泌速率在17℃培养时提高，接近菌株 RUT C-30在 28℃培养时的分泌速率。Suh等（1986，1988）比较了T.reesei QM6 a和T.reesei RL-P37在25℃，30℃和37℃培养时的木聚糖酶和内切葡聚糖酶分泌情况，发现低产量菌株QM6 a在较高温度培养时蛋白质分泌量下降，但菌株RL-P37的产量却有所提高；但两个菌株的木聚糖酶活性在高温培养时都得到了提高。11.1.4.5 细胞壁在蛋白质结合与释放中的作用在快速生长期，真菌的许多胞外蛋白质在分泌以后结合在细胞壁上，木霉的一些分泌型蛋白质也存在这种现象。Kubicek（1981，1982，1983）利用β-葡糖苷酶作为模式，研究了木霉分泌型蛋白与细胞壁的结合情况，发现分泌型酶总活性的80%与细胞壁有关联（Kubicek，1981），细胞壁也是限制商业纤维素酶产量的因素。β-葡糖苷酶对细胞壁的结合程度与细胞壁成分及更新动态有关。与β-1，3-葡聚糖酶或者几丁质酶共培养时，β-葡糖苷酶能够释放出来，如果木霉细胞壁中含有高水平的β-1，3-葡聚糖酶，总β-葡糖苷酶分泌量增加的部分即出现在培养液上清中（Kubicek，1982）。另外，在山梨糖（同质异形诱变剂）存在时，木霉在生长过程中向培养液中的释放β-葡糖苷酶量可被提高（Ku-bicek，1983；Nanda et al.，1986），已知山梨糖能够抑制β-1，3-葡聚糖的合成。这些研究结果都支持如下假设：即细胞壁中的β-1，3-葡聚糖组分参与β-葡糖苷酶对细胞壁的结合。然而，在细胞壁酶解过程中，细胞壁中仍有多糖与β-葡糖苷酶紧密结合，通过对这些细胞壁多糖成分的纯化分析，发现β-葡糖苷酶与复杂的异型多糖有关联，这些多糖由甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成（Messner et al.，1990a）。有趣的是，这种异型多糖在细胞壁中能够结合β-葡糖苷酶，但在体外则能够激活β-葡糖苷酶。经过核磁共振技术（NMR）分析，发现这种能够激活β-葡糖苷酶的异型多糖结构骨架为线形的a-1，6-D-甘露聚糖（Rath et al.，1995）。Perlińska-Lenart等（2006a）将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）编码长醇基一磷酸甘露糖合成酶的dpm1基因转到T.reesei中获得超量表达，结果提高了蛋白质糖基化强度和分泌量，而且引起了木霉细胞壁的超微结构变化。在化学组成方面，细胞壁中的N-乙酰基葡萄糖的含量增加，暗示几丁质含量提高，用荧光增白剂（Calcofluor White）染色后发现几丁质在细胞壁中的分布也发生了改变。还发现甘露糖及碱溶性β-1，6葡聚糖的含量减少。通过比较原生质体与菌丝的蛋白分泌情况，发现转化子的细胞壁是蛋白分泌的一道屏障，阻碍了蛋白分泌。分泌蛋白糖基化水平的提高，减少了核糖量，从而限制了细胞壁多糖的合成，但甘露糖及碱溶性β-1，6葡聚糖的含量减少又使得细胞壁的孔隙率提高，反而有利于蛋白质的分泌。

木霉中蛋白质代谢

蛋白质是由氨基酸经过缩合形成肽链，肽链经过不同形式折叠形成的。Wilhite等（2001）从绿木霉（T.virens）中克隆了一个5056 bp的编码肽合成酶（PSY1）的cDNA片段。基于EST数据库，从哈茨木霉（T.harzianum）CECT2413中分离获得一个编码的PTR家族二/三肽转运体的基因ThPTR2。分析ThPTR2蛋白质序列发现，其具有PTR转运体的保守基序和12个跨膜域。此外，ThPTR2 转化长枝木霉（T.longibrachiatum）T52，过表达ThPTR2，证明了该基因在肽转运中的作用。ThPTR2首次被实验证实为丝状真菌中PTR家族转运蛋白（Vizcaínoa et al.，2006）。蛋白质水解产生不同的氨基酸，Sanz等（2004）也利用18株木霉对5种公认的同工酶β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.39，EC3.2.1.58）、β-1，6-葡聚糖酶（EC3.2.1.75）、纤维素（EC3.2.1.4，EC3.2.1.21，EC3.2.1.91）、几丁质酶（EC3.2.1.30，EC3.2.1.52）和蛋白酶（EC3.4.11，EC3.4.13-19，EC 3.4.21-24，EC3.4.99）的活性进行了多态性分析。唐雯等（2008）利用生物信息学方法对里氏木霉（T.reesei）分泌组进行分析，其中，在188条水解酶序列中，属于蛋白水解酶的序列有33条，包括羧基肽酶（3.4%）、氨基肽酶（1.7%）和天冬氨酰蛋白酶（4.76%）等；在功能未知的水解酶中，发现具有潜在蛋白水解酶功能的序列9条（精氨酸酶、丝氨酸酶和金属钛酶）。上文提到，在木霉中发现了大量的胞外蛋白水解酶，进行了蛋白质水解。Geremia等（1993）在木霉中鉴定了一个基本的蛋白酶（PRB1），蛋白酶经纯化和生化特征分析发现是一种31kDa大小，等电点为9.2的丝氨酸蛋白酶。Dunaevsky等（2000）确定哈茨木霉（T.harzianum）分泌的胞外蛋白酶是一种对Z-丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-pNa-枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的底物具有活性的蛋白酶。Kredics等（2004）对6个长枝木霉（T.longibrachiatum）菌株的胞外蛋白水解酶分析发现，其水解酶具有类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和类凝乳弹性蛋白酶的蛋白酶活性。一个编码细胞外天冬氨酰蛋白酶的基因papA从哈茨木霉（T.harzianum）CECT 2413中被分离鉴定。从过表达哈茨木霉 CECT 2413papA的转化酵母培养物中提取的蛋白酶活性相比野生型增加了四倍（Delgado-Jarana et al.，2002）。随后，新的天冬氨酰蛋白酶在哈茨木霉（T.harzianum）（Suáreza et al.，2005；Liu et al.，2007）、棘孢木霉（T.asperellum）（Yang et al.，2013）中被分离获得。里氏木霉（T.reesei）天冬氨酸蛋白酶（TrAsP）的晶体结构也被研究，TrAsP的三维结构与胃蛋白酶样家族的其他成员结构类似。每个分子都折叠成一个N-末端和C-末段相同大小的β-折叠片的结构（Nascimentoa et al.，2008）。同时，丝氨酸蛋白酶也从哈茨木霉（T.harzianum）（Suarez et al.，2004；Liu et al.，2013）、绿木霉（T.virens）（Pozo et al.，2004）、假康宁木霉（T.pseudokoningii）（Chen et al.，2009）中被分离，编码这些水解酶的基因被克隆。甲丝氨酸肽链内切酶已从绿色木霉（T.viride）培养物滤液中被纯化。确定的等电点为7.3。研究发现，类胰蛋白酶为绿色木霉（T.viride）中含有的特异性蛋白酶（Uchikoba et al.，2005）。Kredics等（2008）从 11 株木霉中筛选深绿木霉（T.atroviride）T221具有耐寒性，在含酪蛋白培养基上培养的深绿木霉（T.atroviride）T221培养液中分离获得一种分子量为24kDa的酶，该酶等电点为7.3，最佳 pH 值为6.2，反应最适温度为25℃并具有低温稳定性，是一个真正的冷适应性酶。底物特异性的数据表明，这种酶是一种优先作用于 Arg 或 Lys的 P1 位置的蛋白酶（Kredics et al.，2008）。Mattinen等（2008）在里氏木霉（T.reesei）中分离一种新的酪氨酸酶（TrTyr），具有催化氧化、氧化交联的牛血清白蛋白（BSA）和β-酪蛋白肽链中的L-酪氨酸和酪氨酸长链的活性。Dixit等（2011a）从绿木霉（T.virens）中克隆获得一个谷胱甘肽转移酶基因TvGST，TvGST转基因植物对重金属镉表现出更强的耐受性（Dixit et al.，2011）。Saloheimo等（1999）在里氏木霉（T.reesei）中分离一个编码蛋白质二硫键异构酶的基因pdi1。里氏木霉（T.reesei）pdi1的 mRNA的水平受碳源调控，在含葡萄糖培养基中表达量最低，在含可以诱导胞外酶基因表达的碳源的培养基上表达量最高（Saloheimo et al.，1999）。