一些测序的基本概念
基础不牢地动山摇~ 趁着放假整理一些常看常忘的知识点 正义链 ：DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链； 反义链 ：mRNA转录时结合的那条链称之为模板链，即碱基互补配对的那条链。 非模板链 = 编码链（coding strand）= 正义链（sense strand） 模板链 = 非编码链（noncoding strand） = 反义链（nonsense strand） 对于一个参考基因组，一条链被指定为 正链 forward ，那么另一条就是 负链 reverse 。这种定义是十分硬核的，并没有什么生物学意义。 RNA 包括： ①反转录合成cDNA：磁珠富集mRNA（具有polyA尾巴）→mRNA随机打断→以mRMA为模板合成第一条cDNA链和第二条cDNA链 形成油包水液滴（Gel Beads、单个细胞、酶的混合物） 简单来说就是通过poly-dT与随机引物与mRNA 3‘端的poly(A)尾结合，反转录生成cDNA。合成的cDNA的3‘端通过ccc结合Barcode，与普通转录组基本一致。
测序的一些基本小知识
PE ：两端测序(Pair-end sequencing),对于Paried-end reads，一般是不会测通的（就是说不会有重合的部 分），比如300bp的插入片段（insert size），两端各测100bp，中间的100bp没有被测到，也就是说对于这个 300bp的插入片段，测序得到的一对reads只有200bp信息，中间的100bp是gap。 Unigene :对转录组进行组装，得到尽可能长的非冗余的序列。我们把最终序列称之为Unigene，每一个Unigene代表一段转录组序列。对组装后的Unigene的数量、长度、GC含量等进行统计，这些统计量反映了组装的质量。Unigene长度通常是反映组装质量的指标之一。对样本的每个Unigene预测ORF（open reading frame），如果一个Unigene预测有多个ORF，则取最长的ORF。把每个Unigene的可读框翻译成氨基酸序列，并且统计读框中每个片段的起始位点，终止位点，长度和GC含。 de novo 测序(从头测序) ：是指在没有任何参考基因组序列时对植物基因组进行测序和组装。 全基因组重测序 ：全基因组重测序是对基因组序列已知物种的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平进行差异性分析的方法。基于全基因组重测序技术，我们能够快速的进行种子资源普查筛选，寻找到大量基因变异，并实现遗传进化分析及重要性状候选基因预测。而随着测序成本降低和已知基因组序列的物种增多，重测序已成为动植物育种研究中最为迅速有效的方法之一。 1M reads指100万条reads。
测序小知识之名词解释
1、Read depth Read深度：一个样本测序得到的reads数；容易和基因组测序的覆盖度 (多少基因组区域被测到了)和测序深度混淆 (单个核苷酸被测到的次数或所有核苷酸被测到的平均深度)。
2、Short-read 短读长：测序得到的长度最大是500 bp的reads，常见的测序片段长度为100-300 bp；本文中的短读长测序片段代表测到的mRNA片段和降解了的mRNA。
3、Long-read 长读长：测序得到的超过1000 bp的reads，本文中代表全长或近乎全长的mRNA。
4、Direct RNA sequencing (dRNA-seq): 直接测序RNA而非cDNA的测序技术，通常用于测序全长或近全长的mRNA 。
5、Multi-mapped reads 多重比对的reads：从转录组同源区域测序得到的reads，不能精确确认其转录本或基因组的来源。
6、Synthetic long reads 合成long reads：通过组装多个短读长得到长读长的方法。
7、唯一分子标识符（UMIs）：在扩增前，构建RNA-seq文库的时候加入的短序列或barcodes，理想情况下每条转录本结合一个唯一的标识符，含有此标识符的reads都来源于此转录本，定量时只计算一次。可以用来降低RNA-seq的定量偏好性，在RNA起始量低的单细胞实验中尤为适用。
8、Read length 读长：单个测序reads的长度，short-read RNA测序得到的长度通常是50-150 bp。
9、Sensitivity 敏感性：样本中多大比例的转录本会被测到，敏感性越高，这一比例越高。它受样本处理、文库制备、测序和计算偏好性的影响。
10、Specificity 特异性：度量差异表达转录本被正确鉴定出的比例的方法，它受样本处理，文库制备，测序和计算偏好性的影响。
11、Duplication rates 重复Reads比率：比对到转录组相同位置的的测序reads的比例。在RNA-seq文库中，一些转录本可能有高的重复率，因为它们在样本中表达水平高。高表达的基因的重复率很高，而低表达基因的或许有着最小的重复率。由此RNA-seq面临着一个挑战，该技术中大部分重复可能是高表达转录本带来的真实信号，而另一些则是由于扩增和测序偏好性造成的。
12、Single-end sequencing 单端测序 (SE)：只测序cDNA片段的一端，因其费用低，常用于只关注差异基因表达的项目中。（NGS基础 - 高通量测序原理）
13、Paired-end sequencing 双端测序 (PE)：cDNA片段两端分别测序，可以测序到cDNA的更多碱基，更好的识别剪接位点，常于差异基因表达分析项目。
14、生物学重复：对生物来源不同的样本的多次检测，比如来自三个个体的组织，用于捕获生物个体自身的变化；这个变化要么是待研究的对象，要么是噪音。相较之下，技术重复是对同样的样本做重复的操作—比如，对一个组织做三次处理。
15、Expression matrix 表达矩阵：差异表达RNA-seq项目的核心数据文件。每一行代表一个RNA，比如基因或者转录本。每一列是一个测序的样本。矩阵中的数值是每个RNA的reads数。这些可能是对转录异构体的计数估计，并通常在后续的分析前先进行标准化转化。
16、Spike-in control 内参：按特定浓度添加到样品中的外源核酸库。它们通常是预先合成的不同浓度的RNA，用于监测反应效率和技术方法的偏差和假阴性结果。
17、Spatialomics 空间转录组学：能保留给定样本（通常是组织切片）中每个转录本的空间信息的转录组分析方法。
18、Nascent RNA 新生RNA：刚刚转录出来的RNA，与已经加工并运输到细胞质的RNA相对应。
19、Translatome 翻译组：细胞、组织或生物体中正在翻译成蛋白质的mRNA集合。
20、Structurome 结构组：细胞、组织或生物体中RNA的二级和三级结构集合。
21、Interactome 互作组：细胞、组织和生物体中分子相互作用的集合，包括有RNA-RNA或者RNA-蛋白质的相互作用。
22、Differential gene expression (DGE) 差异基因：两个实验组中表达显著变化的基因
二代测序名词解释
二代测序（NGS），又称为高通量测序，是低成本、高准确度、一次可对多个样本的几十万甚至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析的新一代测序技术，虽然已被广泛运用于临床，但尚无科学协会对其在肿瘤学实践中的应用提出建议。
早在2018年，欧洲肿瘤内科学会（ESMO）发布了分子靶点临床可行性量表（ESCAT），根据对患者管理的影响将分子靶点分为6个等级，针对导致全球死亡最多的8种癌症中所发生的基因组改变，ESCAT量表评估了其证据等级和临床意义。
一代测序原理及步骤
一代测序仪利用Sanger测序——双脱氧末端终止法的原理，将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这样的PCR产物与普通PCR不一样，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。1. 应用范围:① De Novo测序② 重测序: 如突变检测、SNPs、插入、缺失、克隆产物验证、比较基因组③ 分型: 如微生物和真菌鉴定、HLA分型、病毒分型④ 其它: 如甲基化分析（重亚硫酸盐测序）和SAGE（基因表达串联分析）方法2. 临床应用肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗
一代测序和二代测序的区别是什么?
一、含义不同：第一代测序：指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量少。第二代测序：为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。二、作用不同：Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。普通的二代测序，全基因组或外显子组测序是将DNA分成小片段，然后对各个片段多次读取（一般是三十次）。然而，如果突变只发生在15-20%的细胞中，三十次读取还不足以可靠地捕捉到它们，尤其是当突变只影响一个基因拷贝时。测序程序在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记的dNTP，例如32PdNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。以上内容参考：百度百科-双脱氧链终止法
