DNA探针、DNA芯片
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问题描述:
它们的工作原理是什么？
解析:
DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。
DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。
当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。
由于DNA分子碱基互补的精确性，单连DNA探针仅与样品中变性处理的DNA单链出现配对杂交，由此决定了探针的特异性。
DNA芯片是一种缩小了的生物化学分析器。通过芯片上微加工获得的微米结构和生物化学处理结合，便可将成千上万的与生命相关的信息集成在一小块玻璃芯片上。
采用芯片可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应，以达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。通过分析可得到大量具有生物学、医学意义的信息。
关于DNA芯片的设想可追溯到1989年，当时美国Affymetrix公司的科学家打算用许多分子研制一种硬币般大小的装置。他们想出一种巧妙的办法，利用光刻法与光化学合成法相结合，在一块平滑的玻璃片上，用不同的分子构建一个高密度网络。开始，他们把某些蛋白质堆放在玻璃片上，一名叫斯蒂芬·福多的年轻科学家立即看出了采用DNA的可能性，他意识到，芯片上的DNA分子就好像一条条细细的分子“维可牢(velcro)”(“维可牢”是一种尼龙刺粘搭链，两面相合即粘住，一扯即分开，用以替代服装上的纽扣等)可选择性地与某些基因，即DNA的短片段结合，从而检查出变异型基因。福多在理论上推定，让未知的DNA样品与分布在DNA芯片上已知的DNA序列接触，就能对其作出鉴定。因为DNA双螺旋的两条单核苷酸链总是遵循“碱基互补”的原则配对，即一条链上的A总是与另一条链上的T相结合，C也总是与G相结合。因此，当一条链上的碱基序 *** 定之后，即可推知另一条链上的碱基序列。这类带有已知DNA序列的芯片就能检测突变基因或碱基的各种改变。
DNA探针详细资料大全
DNA探针（DNA probe）是最常用的核酸探针，为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，用特殊示踪剂（如同位素、酶或有色基团）进行标记；在适当的pH值、温度和离子强度下，DNA探针利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合（杂交），形成双链复合物（杂交体）。杂交体的稳定性取决于两条单链核苷酸之间的互补程度。在严格的条件下（高pH值、高温、低离子强度），不完全匹配的杂交体的两链将会解离，而完全匹配的杂交体将保持双链。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。 基本介绍 中文名 ：DNA探针 外文名 ：DNA probe 用途 ：检测核酸 原理 ：碱基互补配对 来源,制备,优点,标记,杂交方法, 来源 DNA探针根据其来源分为3种：一种来源于基因组中的基因本身，称为基因组探针（genomic probe），可以是基因的全序列，或者基因上的一段序列；另一种是从相应的基因经转录获得mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA探针（cDNA probe）；此外，还可在体外人工合成20～50个碱基的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。 制备 基因组DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和套用。要得到一种特异性DNA探针，常常是比较烦琐的。以细菌为例，细菌的基因组大小约为5×10 6 碱基，约含3000个基因。要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后（如用限制性内切酶做不完全水解）分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库，然后用多种其他菌种的DNA探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其他细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。 cDNA探针是从相应的基因经转录获得mRNA，再通过逆转录酶的作用得到的探针，不含内含子序列。 在体外通过机器可以合成小片段单链寡核苷酸探针。寡核苷酸探针稳定、特异性高，在非常严格的条件下．用寡核苷酸探针进行的杂交试验能检测单个碱基突变和单个碱基的错配，但寡核苷酸探针短，带有的标记物少，敏感性较低。 优点 ①DNA探针多克隆在质粒载体中，制备方法简便； ②DNA探针相对RNA探针（RNA probe）而言不易降解，一般能有效抑制DNA酶活性； ③DNA探针的标记方法较成熟，可用同位素或非同位素标记，有多种方法可供选择。 标记 DNA探针分为两类：同位素标记的探针和非同位素标记的探针。同位素标记的探针通常有很高的放射比活性，杂交的灵敏度高，但使用期限短，且有放射性危害，污染物处置困难，需要特殊的仪器和设备，不适用于普通实验室。近年来非同位素标记法得到很大发展，如酶促标记法（如生物素、地高辛标记法）和化学标记法（如萤光生物素、酶标记法）。非同位素标记的探针保存时间较长、避免了同位素的污染，但不及同位素标记探针敏感。下面以同位素标记法为例介绍DNA探针的标记方法。 1．缺口平移法（nick translation ） 缺口平移法是最常用的探针标记法，反应体系的主要成分有DNA酶I（DNase I）、大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）、三种三磷酸脱氧核糖核苷酸、一种同位素标记的核苷酸（如dATP、dTTP、dCTP，”P—dGTP），其原理如图13—1。首先用适当浓度的DNA酶I在探针DNA双链分子上随机切开若干个缺口（不是切断DNA或将其降解），然后再借助于DNA聚合酶I的5 '→3'的外切酶活性，切去5’末端的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚合酶活性，使 32 P标记的互补核苷酸补入缺口．DNA聚合酶I的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核仟酸所取代。由于反应体系中含有同位素标记的单核苷酸，使新合成的链带有同位素标记，所以缺口平移实际上是同位素标记的核苷酸取代了原DNA链中不带同位素的同种核苷酸。 缺口平移法 2.随机引物法 变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA多个部位互补结合后，按碱基互补原则不断在其3'-OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得放射性比活性很高的DNA探针。 3．末端标记法（end—labelling） 末端标记法不是将DNA进行全长标记，只在其5'端或3’端导入标记物进行部分标记。该标记方法可得到全长DNA探针，因为携带的标记分子较少，所以标记比活性不高。 杂交方法 对任何DNA探针测定来说，杂交反应包括四个基本要素：探针、靶物质（样品中的待测核酸）、检验方法（根据采用的标记物或报告基因而定）和杂交模式。核酸分子杂交可分为液相杂交和固相杂交。 1．液相杂交 液相杂交是让DNA探针和待测核酸在溶液中进行反应。在溶液中，待测核酸和探针均自由运动，增加了两者结合的机会，因此液相杂交要比固相杂交快5～10倍。但液相杂交不易分离杂交体和游离核酸探针，常规套用不易。 2．固相杂交 固相杂交是先将待测核酸样本结合到固相载体上，再与溶于溶液中的检测杂交信号后分析杂交结果。 固相杂交的基本程式是：①准备待测样本；②制备和标记探针；③固相载体的处理；④预杂交、杂交、漂洗；⑤杂交信号检测；⑥结果判断及分析。 常用的固相杂交方法有斑点杂交法、夹心杂交法和原位杂交法等。下面简单介绍几种常用的核酸分子固相杂交方法。 ①斑点杂交法（dot blot hybridization）：最常用的杂交模式．将样品DNA直接点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，在严格的条件下杂交后进行检测。斑点杂交法简单、迅速，不需要限制性核酸内切酶消化DNA，也不需要凝胶电泳和转移，且在一张膜上可检测多个样品。该方法敏感性高，但对杂交条件控制不严可出现非特异性杂交。 ②夹心杂交法（sandwich hybridization）：采用位于待测基因两个相邻但不重叠的DNA序列制作探针，先将第一个不标记的探针（A探针，捕捉探针）吸附于固相支持物（如膜、孔或管）上，捕捉待测样本中与其互补的目标序列，然后加入第二个标记的探针（B探针，检测探针），与其互补序列结合后即可检测杂交信号。夹心杂交法的优点是特异性好，而且对核酸样品的纯度要求不高。 ③原位杂交法（in situ hybridization）：用核酸探针与组织或者细胞中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法。先把待测组织或细胞固定到固相载体上，然后用适当去污剂和蛋白酶、酸等物质处理标本，使标记的核酸探针能进入细胞并与待测核酸形成杂交体，从而可直接检测到组织或细胞内的核酸序列。原位杂交法为细胞甚至亚细胞水平的核酸检测提供了直接的方法。
DNA探针简介
目录 1 拼音 2 注解 1 拼音 DNA tàn zhēn 2 注解 DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百堿基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。 对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞DNA组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列，而原核则没有。因此，真核基因组DNA探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA探针。 DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。
