细胞生物学实验的内容简介
《细胞生物学实验(第3版)》在保留第2版简明、可操作性强等特点的基础上，删除了相对陈旧和不适用的实验，增加了反映目前细胞生物学研究现状和发展趋势的实验，并对每个实验的结构体系进行了调整，强化了要点提示及注意事项，增加了预期实验结果。全书共3篇7章42个实验和11个附录。第一篇7个实验介绍了“普通光学显微镜”、“特殊光学显微镜”、“激光扫描共聚焦荧光显微镜”、“双光子激光扫描荧光显微镜”和“电子显微镜”的原理及使用方法；第二和第三篇从基础性、综合性和设计性实验层面安排了35个实验，涵盖了“细胞形态结构和生理活动”、“细胞分裂与染色体标本制备”、“细胞培养、遗传转化及基因表达”、“染色体分析技术”以及“细胞周期与细胞凋亡”等内容，旨在培养学生的基本实验技能和综合创新能力；附录部分提供了“实验室注意事项”、“实验报告的书写要求”、“离心机转数与离心力换算表及公式”、“常用缓冲液的配制”和“常用细胞生物学词汇”等资料。书后附有部分实验的彩色图片和照片。《细胞生物学实验(第3版)》配有数字课程（基础版）网站。网站内容包括部分实验内容的录像片段、彩色图片和照片，供学有余力的学生学习和教师教学参考。《细胞生物学实验(第3版)》适合作为综合性大学、师范、农林、医学等院校相关专业本科生的细胞生物学实验教材使用，也可供研究生、相关科研及实验技术人员参考。
细胞生物学实验技术有哪些
细胞生物学研究所用的实验技术包括：遗传学、病理学、免疫学、生物化学、基因组学、蛋白质组学和分子生物学的理论和方法探讨疾病发生和发展的分子机制。为整个疾病过程寻求特异的分子诊断指标，以及利用分子生物学技术为这些分子诊断指标建立临床实用的检测方法。
细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。
培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。
小鼠胚胎成纤维细胞的培养
小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 作为原代培养细胞，其刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。虽然MEF传代次数有限，但可早期冻存一些，不断复苏，保持长期使用。MEF 的缺点是无法耐受G418 的筛选。替代方法是从持续表达neo抗性的小鼠品系或转基因品系来分离培养MEF 。利用各种转基因鼠培养的MEF 细胞还是各种基因功能研究的良好工具。
（一）材料
12.5~14.5d 的小鼠胚胎(3~6 只小鼠／次），培养皿（ 直径10cm), DMEM+10%新生牛血清， 15cm 或50cm 离心管（圆底）， PBS 配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手术刀、镊子、剪子等器械。
（二）操作步骤
1. 一般操作
(1) 在培养皿中，解剖出鼠胚，以Hanks 溶液消洗。
(2) 除掉四肢、大脑及内脏（肝脏） 。
(3) 用无菌Hanks 溶液＋PBS 漂洗3 次。
(4) 置培养皿中，用手术剪切碎。
(5) 将剪碎组织移入50ml 离心管中，加入约10ml 消化液。
(6) 37°C摇育10min （置水浴或孵育箱中）。
(7) 吸5ml 上清液放入另一50ml 离心管中，加等体积含10％新生牛血清的DMEM 培养液中和胰蛋白酶。
(8) 再加入4ml 消化液至原离心管（内含组织），颠倒摇动，10min 后再吸出5ml 上清液到另一离心管中，加入5ml 含10% 新生牛血清的DMEM 培养液。
(9) 重复上一步骤5 次左右，此时离心管中仅剩无法消化的软骨等。
(10) 离心50ml 离心管，加50ml 含10％新生牛血清的DMEM 培养液。
(11) 取适量移到培养皿或培养瓶中培养。
(12) 第二天换液，直到细胞长满（汇合），1 : 10 传代，再生长至合适密度时可进行冻存。
(13) 根据实验需要复苏细胞，由于MEF细胞传代数有限，实验时应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。
2. 丝裂霉素处理或γ-射线处理 用作饲养层的MEF 细胞还须进行丝裂霉素处理或干射线处理，步骤如下。
（1） 丝裂霉素处理
复苏冻存的MEF 细胞(5×104个/cm2，保证用时满满一层，不留空间。
汇合状态下的MEF 加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml 丝裂霉紊的DMEM 培养液， 37 °C 、5% CO2培养箱中培养2~3h 。
以PBS 彻底漂洗数次，胰蛋白酶消化，以每分钟1000 转的速率离心5min,收集沉淀，用新培养液悬浮，调整浓度为3×105g 个/ml。
将细胞接种于经明胶预处理的培养皿中。（明胶预处理： 0.1％明胶溶液浸泡2h, 移走多余的明胶，待自然干燥。）
(2)γ-射线处理
汇合状态的MEF 细胞，以30~ 100Gy 的γ－射线处理。
胰蛋白酶消化，收集细胞，离心（每分钟1000 转， 10min )、计数，接种到明胶预处理的培养皿中。Y-射线处理过的细胞也可以5×106个／ml 的浓度冻存起来。复苏后， 1 支冻存管可接种到4~5 块直径6cm 的培养皿中。
如何利用干细胞技术来培育小鼠的技术？
该技术包括首先从雄性老鼠身上提取皮肤细胞，然后将其转化成类似干细胞的状态，以创建所谓的诱导性多能干细胞（iPS cells）——一种可以转化为其他类型细胞的细胞。因为该皮肤细胞从雄性老鼠身上提取，因此具有XY染色体。林克彦教授的团队剔除了其中的Y染色体，再向另一个细胞“借来”一个X染色体，然后将两个X染色体巧妙地“粘”在一起。这一流程使得干细胞变成卵细胞。
“这其中最大的诀窍就是X染色体的复制。”林克彦教授说，拥有两个X染色体的这些细胞被放置在一个卵巢类器官中进行培养，从而形成卵子。当与正常精子受精后，科学家们获得了大约600个胚胎，并将其植入代孕老鼠体内。最终，代孕老鼠诞生了7只小鼠幼仔。
这些小老鼠看起来很健康，会有一个正常的寿命，并在成年后得以继续生育后代。“它们看起来还不错，在正常生长，以后能够成为父亲。”林克彦教授表示。实验中约1%的生产成功率，低于用正常女性卵细胞能够达到的5%的成功率。
不孕不育症患者的新希望？
现阶段该技术还不能安全用于人类
林克彦教授表示，该研究的主要动机是希望能够为罹患不孕不育症的夫妻提供一种生育治疗方法，例如患有特纳综合征的妇女，她们拷贝的X染色体有一整个或部分缺失的情况。
他继续补充，目前，这项研究仍处于早期阶段，卵细胞的质量不高。“即使在老鼠身上实验，卵细胞的质量也存在很多问题。因此，在考虑将其作为一种生育治疗方法之前，我们必须克服这些问题，这可能需要很长的时间。”他表示。
同时，在这个阶段，技术还不能安全地用于人类。但是，他认为这一问题能够在10年内得到解决。然而，部分科学家认为这一时间估计过于乐观，因为目前在实验室条件下还未能从女性细胞中创造出可行的人类卵细胞。并且，也有科学家提出，人类的细胞需要更长的培养时间来产生一个成熟的卵细胞，这可能会增加细胞获得不必要的遗传变化的风险。
此外，林克彦教授还提出对社会是否能够接受这一技术的担忧，他并不赞同男性用自己的精子和人工制造的卵细胞来创造一个婴儿。“在技术上这是可能的。但是我不太确定在现在这个阶段，它是否安全或为社会所接受。”
中国科学院的王浩义教授认为，在考虑将该技术应用于临床之前，还有很长的路要走。“科学家从不说永远，原则上，实验已经在老鼠身上完成了，当然它可能在人类身上实现。但我可以预见到未来（该技术）会遇到很多挑战，我无法预测（克服它们）将花费多少年。”
